PGT-M nei casi di insufficienza ovarica prematura associata a mutazioni del gene FMR1

• I test genetici preimpianto per le malattie monogeniche (PGT-M) hanno segnato un punto di svolta nell’approccio alla consulenza riproduttiva e nella pratica clinica delle malattie genetiche. 

• Permangono difficoltà, tecniche e cliniche. Tra le più impegnative vi sono le malattie correlate al gene FMR1: le procedure e la consulenza PGT-M sono condizionate dalla complessità del locus genetico e dalla limitata disponibilità del campione biologico.

• Crioconservazione, diagnosi prenatale, PGT-M: uno sguardo alle principali opzioni riproduttive, tra opportunità e limiti. 

• Strategia PGT e limitazioni nelle patologie correlate a FMR1: dalla parte analitica alla disponibilità del substrato biologico.

• La PGT-M per POF1 non è una scelta ovvia per le coppie a rischio e dovrebbe essere preceduta da un’approfondita discussione su rischi, limiti e benefici.

Un panorama complesso

I test genetici preimpianto per le malattie monogeniche (PGT-M) hanno segnato un punto di svolta nell’approccio alla consulenza riproduttiva e nella pratica clinica delle malattie genetiche. Tuttavia, permangono difficoltà, tecniche e cliniche, molte delle quali specifiche per una determinata condizione genetica. 

Tra le più impegnative in questo senso vi sono le malattie correlate al gene FMR1, in cui le procedure e la consulenza PGT-M sono condizionate sia dalla complessità del locus genetico, sia dalla limitata disponibilità del campione biologico. Questo a causa dell’esaurimento accelerato della riserva ovarica in specifici sottogruppi di portatrici. 

In questo articolo andiamo a descrivere e a contestualizzare i concetti genetici, clinici e di laboratorio fondamentali del PGT-M nel complesso panorama dei disturbi correlati a FMR1, con una particolare attenzione all’insufficienza ovarica prematura di tipo 1 (POF1; OMIM #311360). Obiettivo: contribuire a sensibilizzare medici, professionisti di laboratorio e pazienti sulle attuali limitazioni e sulle migliori pratiche ad oggi disponibili. 

Insufficienza ovarica prematura: sintomi e cause

L’insufficienza ovarica prematura (POF) è determinata dalla deplezione dei follicoli nelle ovaie, che porta all’infertilità prima dei 40-50 anni. Questo disturbo insorge con:

• amenorrea o oligomenorrea per almeno 4 mesi;
• aumento dei livelli di gonadotropina;
• diminuzione dei livelli di estrogeni. 

Sebbene la maggior parte dei casi di POF sia considerata idiopatica, almeno una parte di essi può essere attribuita a tre cause distinte e riconoscibili. Ovvero anomalie cromosomiche, alterazioni autoimmuni e disturbi monogenici.
Per quanto riguarda le forme ereditarie, è stato riscontrato che oltre 50 geni sono coinvolti nell’eziologia della POF: i più rappresentativi sono FOXL2, CLPP, FSHR e FMR1. Ci concentriamo qui, in particolare, sul gene del ritardo mentale dell’X fragile 1 (FMR1), di cui alcune alterazioni specifiche causano una particolare forma di POF, ovvero POF1, precedentemente nota come insufficienza ovarica primaria associata all’X fragile, o FXPOI. 

Il gene FMR1 e la sindrome dell’X fragile

Il sito fragile del cromosoma X umano (Xq27.3) coincide con un’isola ipermetilata di 76 CpG nel 5′ UTR di FMR1. FMR1 codifica per la proteina FMRP, che è presente in molti organi. I livelli più alti si trovano nel cervello, dove è espresso in diversi neuroni, e nel testicolo.
La proteina FMRP svolge un ruolo importante nella regolazione traduzionale di altri trascritti cellulari. L’isola CpG contiene una sequenza polimorfica di 80 ripetizioni trinucleotidiche (CGG), normalmente compresa tra 5 e 44 ripetizioni. Quando la tripletta CGG si espande oltre le 200 ripetizioni, l’allele viene silenziato, causando la sindrome dell’X fragile (FXS, OMIM 82 #300624). Si tratta della forma ereditaria più comune di disabilità intellettiva, con una prevalenza riportata di 1 su 4.000 maschi e 1 su 8.000 femmine. L’allele FMR1 contenente tra le 55 e 200 ripetizioni corrisponde a una premutazione, che è associata a un aumento del rischio di ulteriori espansioni nelle generazioni successive a causa dell’instabilità del segmento CGG.

Premature ovarian failure-1 (POF1)

La POF1 è una malattia cronica caratterizzata da oligo/amenorrea e ipergonadotropismo prima dei 40 anni. Colpisce all’incirca il 13-20% delle donne con premutazione. 

L’associazione tra la dimensione delle ripetizioni di premutazione e il rischio di insufficienza ovarica non risulta, però, lineare. Nel complesso, il limite inferiore delle dimensioni delle ripetizioni FMR1 che modifica la funzione ovarica non è stato ancora stabilito. Le pazienti che portano espansioni che rientrano nell’intervallo intermedio possono presentare forme più lievi di senescenza ovarica prematura, definita come diminuita riserva ovarica (DOR), per la maggior parte caratterizzata solo da un aumento prematuro delle concentrazioni di FSH della linea di base.
Tuttavia, è stato osservato che non tutte le donne con disfunzione ovarica e DOR sono destinate a sviluppare POF. Per questo motivo, DOR è considerata una caratteristica molto più comunemente associata all’allele FMR1 intermedio rispetto a POF1.
La maggior parte dei portatori di premutazione diventano consapevoli della loro condizione a causa della loro storia familiare di FXS. A causa dei rischi associati all’avere un figlio con FXS e al diventare infertili, la consapevolezza dello stato di portatore di premutazione influenza le decisioni riproduttive. 

La consulenza genetica e la preservazione della fertilità

La consulenza riproduttiva dovrebbe essere fornita alle donne con sintomi di premutazione o POF in età fertile. Dovrebbe includere:

• una valutazione della fertilità completa con un pannello di analisi ormonali;
• consulenza genetica;
• una spiegazione delle opzioni riproduttive disponibili, tra cui il concepimento naturale, le tecnologie di riproduzione assistita, e l’adozione. 
  
  

La consulenza genetica riguardante il rischio di trasmissione della malattia e le scelte riproduttive disponibili dovrebbero essere offerte a tutte le donne portatrici della premutazione FMR1 o della mutazione completa prima di raggiungere l’età riproduttiva. Anche se non si verificasse un completo esaurimento della riserva ovarica, le portatrici potrebbero comunque soffrire di infertilità o sub-infertilità. 

Fattori come lo stile di vita, il background genetico e l’inattivazione del cromosoma X alterato sono considerati possibili fattori che contribuiscono allo sviluppo di POF1 nelle femmine portatrici di premutazione. La conoscenza dei fattori che influenzano la variabilità clinica può aiutare a identificare le donne con un rischio più elevato di complicazioni. Pertanto, si raccomanda di discutere la consulenza sulla fertilità al momento della diagnosi. 

Il valore dei fattori predittivi e le opzioni riproduttive

Per fornire informazioni più efficaci alle portatrici della mutazione FMR1 candidate a procedure di riproduzione assistita, è necessario studiare anche i fattori predittivi per un recupero più efficiente degli ovociti. 

Oggigiorno, oltre all’FSH al terzo giorno, sono stati introdotti parametri più accurati per predire la risposta della riserva ovarica alla stimolazione ormonale. È il caso della conta dei follicoli antrali (AFC) e della valutazione dell’ormone antimulleriano (AMH). È necessario fornire alle coppie informazioni sul potenziale recupero, la disponibilità e i limiti degli ovociti crioconservati nelle procedure di riproduzione assistita. 

Crioconservazione

La crioconservazione degli ovociti è un’opzione che può essere valutata prima dell’insorgenza di insufficienza ovarica prematura. Tuttavia, la sua efficacia nelle pazienti con FMR1 può essere ridotta a causa di alterazioni ovariche determinate dalla malattia genetica sottostante. In ogni caso, prevedere con precisione i tassi di successo della preservazione rimane un compito difficile per i professionisti della medicina riproduttiva, rendendo difficoltosa una consulenza efficace. 

Diagnosi prenatale 

Tra le opzioni riproduttive per le coppie con una storia familiare di FXS, storicamente la più consolidata è la diagnosi prenatale, il cui esito consente alle coppie di scegliere, dopo un’adeguata consulenza genetica, tra la continuazione e l’interruzione volontaria della gravidanza. Tuttavia, la consulenza genetica prenatale nelle famiglie con FXS è complicata dalla difficoltà di predire accuratamente il fenotipo dei nascituri, che può variare significativamente a causa dei tassi di inattivazione del cromosoma X nelle donne, del mosaicismo negli uomini e delle espansioni alleliche intergenerazionali. Inoltre, la diagnosi prenatale seguita dall’interruzione volontaria della gravidanza è spesso vissuta come un peso emotivo. 

Alla luce di tutto ciò, non sorprende che approcci alternativi, come la PGT-M, siano progressivamente diventati un’opzione preferibile, sebbene con alcune limitazioni. 

Strategia PGT-M, in cosa consiste?

Da molti anni, il test genetico preimpianto per le malattie monogeniche (PGT-M) a seguito di una procedura di fecondazione in vitro (FIV) è considerato una valida alternativa alla diagnosi prenatale. Offre, infatti, la possibilità di ottenere una gravidanza con un bambino sano senza lo stress psicologico causato dall’interruzione volontaria di gravidanza. 

• I trattamenti di fecondazione in vitro standard, seguiti da PGT-M, iniziano con protocolli di stimolazione ovarica controllata mediante somministrazione di gonadotropine, aspirazione follicolare transvaginale ecoguidata e successiva iniezione intracitoplasmatica dello spermatozoo in vitro (ICSI). 
• La biopsia embrionale viene solitamente eseguita su cellule del trofectoderma al 3° o 5° giorno di sviluppo. 
• Un test molecolare, che può essere basato sull’amplificazione del target o sull’amplificazione dell’intero genoma, viene quindi utilizzato per selezionare gli embrioni sani. 

Nell’ambito delle patologie correlate a FMR1, l’obiettivo della PGT è la selezione di embrioni femminili con entrambi gli alleli normali e di embrioni maschili emizigoti per l’allele materno normale. 

Limitazioni della strategia PGT nelle patologie correlate a FMR1

La strategia PGT può essere teoricamente proposta a qualsiasi coppia a rischio di trasmettere FXS. Tuttavia, i professionisti coinvolti nella PGT per patologie correlate a FMR1 dovrebbero essere consapevoli dei limiti e problemi specifici. Questi sono principalmente attribuibili a due aspetti: uno riguarda la parte analitica della procedura PGT, l’altro la disponibilità del substrato biologico, ovvero gli ovociti fertili.

Procedura analitica PGT

Per quanto riguarda la procedura analitica, il principale fattore limitante è il numero di ripetizioni CGG, sia nell’allele sano che in quello patologico, che è particolarmente rilevante quando si cerca di distinguere embrioni femminili sani da quelli portatori. Nuove strategie vengono, però, continuamente sviluppate e progressivamente integrate nella pratica clinica. 

Disponibilità del substrato biologico

La principale limitazione biologica del PGT-M nei disturbi FMR1 riguarda le portatrici di premutazione femminile, a causa del loro rischio più elevato di POF rispetto agli individui con alleli normali o completamente espansi. Le portatrici di premutazione FMR1 mostrano una risposta inferiore alla stimolazione ovarica anche quando vengono somministrate dosi più elevate di gonadotropine. Presentano anche livelli di picco di estradiolo più bassi, meno ovociti recuperati e tassi inferiori di blastulazione rispetto ai controlli. Al contrario, sono stati riportati tassi simili di gravidanza e nati vivi per trasferimento di embrioni allo stadio di clivaggio.
Indipendentemente dallo stato della mutazione FMR1, la PGT-M dovrebbe essere offerta alle pazienti solo dopo la valutazione della riserva ovarica. Infatti, alcuni autori hanno riportato che il successo della PGT è correlato al numero di ovociti recuperati e che le probabilità si riducono notevolmente con una bassa risposta ovarica. 

Per le portatrici di premutazione FMR1, l’obiettivo di ottenere cicli di PGT-M di successo può essere impegnativo. La funzionalità ovarica compromessa si manifesta in una ridotta riserva ovarica e qualità ovocitaria, con conseguente prevedibile recupero di un minor numero di ovociti dopo la stimolazione ovarica e, di conseguenza, un minor numero di embrioni disponibili per la biopsia. Alcuni studi hanno determinato che è necessario un pool ideale di 7-10 ovociti in metafase II per ottenere almeno un embrione sano.
A questo proposito, va notato che solo gli embrioni che non portano l’allele affetto sono considerati sani, poiché la determinazione specifica del numero di ripetizioni CGG non è sempre possibile e quindi l’espansione patologica degli alleli premutati potrebbe non essere rilevata. La conseguente esclusione degli embrioni portatori di premutazione riduce ulteriormente la possibilità di ottenere una gravidanza di successo. 

PGT-M per POF1: rischi, limiti e benefici 

La premutazione di FMR1 è tra le più importanti cause monogeniche di POF. Per questo motivo, l’analisi delle espansioni CGG di FMR1 nelle donne con segni di disfunzione ovarica ad eziologia sconosciuta può rivelarsi un approccio diagnostico decisivo e appropriato. L’analisi dovrebbe includere la valutazione della struttura del gene FMR1, includendo sia la ripetizione CGG, sia il pattern di interruzione AGG.
Inoltre, la diagnosi nelle giovani donne consente un’adeguata consulenza genetica per pianificare le loro prospettive riproduttive considerando una possibile disfunzione ovarica. Anche la stima della riserva ovarica o di qualsiasi variabile legata alla COH è importante. Le ripercussioni della premutazione, dell’espansione intermedia e della mutazione completa di FMR1 sulla risposta alla stimolazione ovarica e sulla successiva efficacia dei risultati della PGT-M rimangono in discussione.
Per quanto riguarda le opzioni riproduttive, la PGT-M per POF1 non è una scelta ovvia per le coppie a rischio e dovrebbe essere preceduta da un’approfondita discussione attorno ai suoi rischi, limiti e benefici. Tuttavia, una scarsa risposta ovarica, così come i limiti tecnici della procedura diagnostica, possono impedire a specifici sottogruppi di coppie a rischio di accedere alla tecnica. Sono necessari ulteriori studi per una migliore comprensione dei meccanismi molecolari responsabili di POF1 nelle pazienti premutate, poiché ciò sarebbe fondamentale per lo sviluppo di nuovi trattamenti e l’identificazione di biomarcatori precoci di POF imminente.

NOTE
Per approfondire: PGT-M for ovarian insufficiency linked to CGG repeat expansion of the FMR1 gene; T. Persico, M. L. Tranquillo, R. Seracchioli, D. Zuccarello e U. Sorrentino; Genes 2024, 15, 6.